Нашёл интересное. Наука потихонечку Разворачивается лицом к Ежевике
В Госреестр сортов допущенных к использованию на 2015г уже включены сорта Агавам и Торнфри.

А вот первые шаги по исследованию генотипа некоторых сортов. Просматривается дальняя цель регулирования рынка. Первые попытки достаточно робки и не значительны, но процесс идёт.

ПАСПОРТИЗАЦИЯ СОРТОВ МАЛИНЫ И ЕЖЕВИКИ И ИЗУЧЕНИЕ ИХ ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИХ ВЗАИМООТНОШЕНИЙ МЕТОДОМ RAPD-АНАЛИЗА
27.07.2015Научные статьиежевика + малина + микроклон + сорт

ПАСПОРТИЗАЦИЯ СОРТОВ МАЛИНЫ И ЕЖЕВИКИ И ИЗУЧЕНИЕ ИХ ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИХ ВЗАИМООТНОШЕНИЙ МЕТОДОМ RAPD-АНАЛИЗА

Д.И. Каган1, К.А. Шестибратов2,3, В.Г. Лебедев2,3, А.Б. Азарова2,3, М.С. Филиппов3, С.А. Бесов4, С.И. Ивановская1, О.А. Ковалевич1, М.М. Барсукова1

1 ГНУ «Институт леса Национальной академии наук Беларуси», ул. Пролетарская, 71, Гомель, 246001, Беларусь, e-mail: quercus-belarus@mail.ru

2 Научно-производственное предприятие «МИКРОКЛОН», Микрорайон АБ, 23, Пущино, 142290, Россия, e-mail: director@microklon.ru

3 Филиал Института биоорганической химии имени академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН, Проспект Науки, 6, Пущино, 142290, Россия, e-mail: filippmv@gmail.com

4 ООО «ФИЛАГР», ул. Шверника, дом 16, корпус 1, Москва, 117036, Россия, e-mail: filagr.director@yandex.ru

Ключевые слова: ДНК-маркеры, полимеразная цепная реакция, RAPD-анализ, сорт, малина, ежевика, генетический паспорт.


Введение.

Малина и ежевика являются ценными ягодными культурами, сладкие и ароматные плоды которых широко используются как в свежем виде, так и для переработки. По производству плодов малины лидирующее место занимает Российская Федерация, на долю которой приходится около 30% валового сбора ягод в мире (с учетом сбора плодов в дикорастущих насаждениях) [1]. Только за последние пять лет в Государственный реестр селекционных достижений РФ включено 20 новых сортов малины. Все это делает задачу идентификации и паспортизации уже существующих и новых сортов весьма актуальной.

В настоящее время для маркирования сортов малины и ежевики используются как количественные признаки (число побегов, длина междоузлий, длина ягоды), так и качественные (окраска цветка, листьев, побегов и ягод, профиль и морщинистость листьев), которые выявляются визуально в фенотипе растений [2]. Одним из основных недостатков таких признаков является существенная зависимость их проявления от условий выращивания, а также затрудненная идентификация в определенные сезоны года, например, в отсутствие цветения или плодоношения. В результате заключение о принадлежности используемого посадочного материала к тому или иному сорту можно сделать лишь с определенной долей вероятности.

В связи с вышесказанным более эффективной и перспективной системой маркирования селекционных достижений является генетическая паспортизация сорта, представляющая собой метод получения генетически детерминированных характеристик с помощью молекулярных маркеров. К настоящему времени опубликован ряд зарубежных работ по ДНК-маркированию сортов малины и ежевики, культивируемых в странах Америки и Европы [3-5].

В данном исследовании представлены результаты молекулярно-генетической паспортизации сортов малины и ежевики, районированных в Российской Федерации, и изучения их филогенетических взаимоотношений методом RAPD-анализа.


Материалы и методы.

Экспериментальным материалом для исследований являлись 19 сортов малины и ежевики: Агавам, Атлант, Бабье лето II, Беглянка, Блэк Сатин, Бриллиантовая, Брянское диво, Геракл, Желтый гигант, Золотая осень, Кумберленд, Логанберри, Лаутон, Оранжевое чудо, Пингвин, Солнышко, Тайберри, Торнфри, Элегантная.

Выделение ДНК из листьев растений проводили модифицированным СТАВ-методом [6]. Для паспортизации сортов и их RAPD-анализа использовался набор из шести олигонуклеотидных праймеров (Oligo 4: 5’-CAAACGGCAC-3’; Oligo 6: 5’- CACGGCGAGT-3’; Oligo 29: 5’-AAGAGCCCGT-3’; Oligo 94: 5’-GGACGGGTGC-3’; Oligo 98: 5’-GGGTAACGCC-3’; Oligo 105: 5’-AATCGGGCTG-3’). Полимеразная цепная реакция (ПЦР) проводилась по следующей программе: 1 цикл – длительная денатурация (3 мин., 94 0С); 40 циклов – денатурация (30 c, 94 0С), отжиг (30 c, Ta (температура отжига) = Tm (температура плавления) – 2 0С), элонгация (45 c, 72 0С); 1 цикл – длительная элонгация (7 мин., 72 0С).

Для электрофоретического разделения продуктов ПЦР использовали 1-1,5% агарозные гели, приготовленные на Трис-ЭДТА-Боратном буфере. Выявление электрофоретических спектров осуществляли путем помещения гелевой пластины в раствор бромистого этидия. Результаты электрофореза документировали в системе Image Master VDS.

Интерпретацию результатов проводили визуально на основе составления бинарных матриц по каждому из праймеров, в которых отмечалось наличие (1) или отсутствие (0) ампликонов с одинаковой молекулярной массой на электрофореграмме. Каждый ПЦР-фрагмент рассматривался как отдельный генетический локус. Оценка степени генетических различий между подвидами проведена по методу Неи [7]. В качестве алгоритма построения кластеров использован метод парно-группового арифметического усреднения (UPGMA).


Результаты и обсуждение.

В ходе RAPD-анализа 19 сортов малины и ежевики с использованием шести праймеров были выявлены 21 локус, использованные в дальнейшем при составлении генетических паспортов. По четыре локуса обнаружено при амплификации ДНК с праймерами Oligo 4, 6, 29, 98, три – с Oligo 94, два – с Oligo 105. При этом 19 локусов являлись полиморфными и только два (праймер Oligo 98) – мономорфными.

Использованные праймеры позволили получить четкие воспроизводимые ампликоны. Выявленный полиморфизм дал возможность дифференцировать генотипы 17 проанализированных сортов, составленные генетические паспорта для которых являлись уникальными. Для двух сортов (Торнфри и Блэксатин) различий по RAPD-спектрам обнаружено не было.

Степень генетических различий между исследованными сортами была установлена по значениям коэффициентов генетической дистанции Неи (DN). Вследствие выявления идентичных RAPD-спектров для сортов Торнфри и Блэк Сатин генетических различий между ними не обнаружено (DN=0). Наименьшее значение DN (0,100) выявлено между сортами: Солнышко и Беглянка, Солнышко и Желтый гигант, Золотая осень и Пингвин.

Наибольшие различия по генетической дистанции выявлены между сортами Лаутон и Тайберри (1,435) и сортами Лаутон и Желтый гигант, Лаутон и Логанберри, Агавам и Желтый гигант (для всех трех пар значение DN составило 1,253). Среднее значение DN для проанализированных сортов равно 0,494. На основании полученных значений DN построена дендрограмма генетической дифференциации сортов малины и ежевики (рисунок).



Рисунок. Дендрограмма, иллюстрирующая степень генетической дифференциации проанализированных сортов малины и ежевики по данным RAPD-маркирования.


Анализ полученных результатов позволил установить связь между особенностями кластеризации исследуемых сортов и их сортовыми характеристиками и происхождением. Так, например, сорта Агавам, Торнфри, Лаутон и Блэк Сатин, обособившиеся в отдельный кластер, относятся к ежевике, а остальные – к малине (кроме Тайберри и Логанберри, являющиеся малино-ежевичными гибридами). При этом генетических различий межу сортами Торнфри и Блэк Сатин не выявлено, что является отражением их общего генезиса (сорт Торнфри является родительским для сорта Блэк Сатин). Данные сорта характеризуются также и значительным фенотипическим сходством, различаясь лишь окраской плодов до стадии полного созревания и несколько бóльшим максимальным размером ягод у Блэк Сатина, по сравнению с Торнфри. Необходимо отметить, что для плодово-ягодных культур (на примере земляники) показана возможность выделения в пределах сорта по компонентам продуктивности и фенологическим характеристикам внутрисортовых групп, позволяющих рассматривать их как экоэлементы структуры сорта, способных к самовоспроизводству [8]. Тем не менее, опубликованные к настоящему времени результаты генотипирования сортов Блэк Сатин и Торнфри с использованием SSR- маркеров позволили дифференцировать их генотипы [9].

Самую многочисленную группу сформировали ремонтантные сорта малины (Атлант, Бабье лето II, Геракл, Бриллиантовая, Брянское диво, Золотая осень, Оранжевое чудо, Пингвин, Элегантная) и два малино-ежевичных гибрида. При этом гибриды объединились в один кластер с сортами малины, что свидетельствует о бóльшем генетическом сходстве между ними, по сравнению с ежевикой. Необходимо отметить, что многие сорта ремонтантной малины также являются результатом межвидовой гибридизации различных видов подрода Малина. Растения подгруппы, сформированной сортами Атлант, Бабье лето II, Геракл и малино-ежевичных гибридов Тайберри и Логанберри, характеризуются красной и темно-красной окраской плодов, соответственно. В отдельную группу вошли сорта малины Беглянка, Солнышко, Желтый гигант, Кумберленд, характеризующиеся, в основном, ранними сроками созревания. Исключение составляет Желтый гигант, который относится к сортам со среднеранними сроками созревания и является ремонтантным. Своеобразным генотипом характеризуется и единственный районированный в Российской Федерации сорт черноплодной малины Кумберленд, о чем свидетельствует его расположение на дендрограмме крайним снизу.


Заключение.

На основании использования 21 RAPD-локуса проведено генотипирование 19 сортов малины, ежевики и гибридов, изучены их филогенетические взаимоотношения. Установлено, что уровень генетической дифференциации и результаты кластеризации изученных сортов связаны с их сортовыми характеристиками и происхождением.

Первоисточник http://microklon.ru/page/pasportizacija-so...om-rapd-analiza